葡萄籽原花青素对顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞TM4细胞凋亡的影响

顺铂(cDDP)是最有效的抗肿瘤药物之一,广泛应用于多种肿瘤的治疗,如睾丸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌等,但由于对人体众多器官具有毒副作用,因此,限制了它在医疗方面的应用。葡萄籽原花青素(GSPE)是从葡萄籽中分离提取出的一种天然的具有生物类黄酮活性的多酚化合物,具有抗炎、抗肿瘤、保护心血管系统、抗辐射、抗衰老等广泛的作用。其中,由于其结构中含有多个酚羟基,更使得它能有效清除氧化物和自由基,表现出极好的抗氧化作用。除此之外,GSPE在抗肿瘤方面也备受社会关注,研究表明,GSPE可以诱导多种癌细胞凋亡。

北京联合大学生物化学工程学院的杜月梅、韩何丹和高丽萍*等人运用cDDP造模,通过测定GSPEcDDP所致TM4细胞凋亡及凋亡相关蛋 白BaxBcl-2Caspase-3表达量的影响,探究GSPEcDDP所致TM4细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。以期为GSPE应用于临床提供实验依据,为男性癌症患者提供有效的化疗辅助品及减少cDDP应用于临床化疗的局限性。



1 cDDP对TM4细胞生长的抑制作用


用不同质量浓度的cDDP处理TM4细胞24 h,结果显示,随着cDDP终质量浓度的增大,对TM4细胞的抑制率逐渐升高,各质量浓度cDDPTM4细胞抑制率与空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。cDDPTM4细胞IC50为(0.014 0±0.000 3mg/mL,因此选择0.014 mg/mL质量浓度的cDDP用于后续实验。


2 GSPE对TM4细胞生长的影响


结果显示,随GSPE终质量浓度的升高,TM4细胞存活率逐渐增高,在GSPE终质量浓度为0.010 mg/mL时,TM4细胞存活率达到最高,此后随GSPE终质量浓度增加,TM4细胞存活率逐渐降低。当GSPE终质量浓度高于0.500 mg/mL时,TM4细胞存活率显著低于空白对照组,即高质量浓度GSPETM4细胞生长具抑制作用。不同终质量浓度GSPETM4细胞存活率与空白对照组(GSPE终质量浓度为0 mg/mL)相比,存在极显著差异(P<0.01)。由此数据计算得到GSPE单独作用24 hTM4细胞的IC50为(0.956 0±0.001 2mg/mL。 



3 GSPE对cDDP诱导TM4细胞毒性的保护作用


用终质量浓度为0.014 mg/mLcDDP建立TM4细胞损伤模型,用不同终质量浓度的GSPE提前24 h处理TM4细胞。结果显示,与cDDP模型组对比,cDDP+GSPE组细胞存活率极显著提高(P<0.01),但随着GSPE质量浓度的升高,细胞存活率先升高后降低。这表明cDDPTM4细胞有明显的抑制作用,而在一定质量浓度范围内,GSPEcDDP所致细胞损伤具有明显的保护作用,0.005 mg/mLGSPE保护效果最佳。 



4 各组TM4细胞凋亡率变化


由图4可知,cDDP可造成TM4细胞各时期凋亡率及死亡率升高,与空白对照组相比较具有极显著性差异;若细胞先经GSPE提前作用2 h,再由cDDP诱导作用24 h,则此时TM4细胞凋亡率增高的程度明显降低,表明终质量浓度为0.005 mg/mLGSPE0.014 mg/mLcDDP所诱导TM4细胞凋亡具有很好的拮抗作用,对TM4细胞起到保护作用,提示GSPE可能参与调控cDDP诱导的TM4细胞的凋亡途径。



5 各组TM4细胞凋亡形态变化


由图5可知,空白对照组细胞呈疏散状,发出均匀荧光,荧光亮度较浅,呈浅蓝色;cDDP模型组多数细胞变圆、与临近细胞相分离,大量细胞已脱壁,贴壁细胞数目明显减少,细胞核出现致密浓染的颗粒状高亮荧光物,荧光强度与正常细胞相比较明显增强,凋亡细胞明显增多;GSPE对照组细胞贴壁紧密,细胞呈均匀浅蓝色荧光,其染色形态与空白对照组相似,无明显变化;GSPE+cDDP实验组细胞脱壁现象较cDDP模型组明显减少,细胞多数贴壁生长,胞体变圆现象远少于cDDP模型组,与cDDP模型组相比较细胞核出现致密浓染的颗粒状荧光明显减少。结果表明,终质量浓度为0.005 mg/mLGSPE0.014 mg/mLcDDP所诱导TM4细胞凋亡形态学改变具有很好的拮抗作用。 



6 各组TM4细胞凋亡相关蛋白表达的变化 


如图67所示,终质量浓度为0.014 mg/mLcDDP作用于TM4细胞24 h后,细胞内Bcl-2相对表达量(28.91±1.07%与空白对照组(52.30±3.14%相比显著降低(P<0.01);若细胞先经GSPE提前作用2 h,再由cDDP诱导作用24 h,则此时细胞内Bcl-2相对表达量((38.43±1.12%)与cDDP模型组相比极显著升高(P<0.01);0.005 mg/mLGSPE单独作用于TM4细胞,其细胞内Bcl-2相对表达量(54.92±2.81%与正常TM4细胞内Bcl-2相对表达量不存在显著性差异。


如图68所示,终质量浓度为0.014 mg/mLcDDP作用于TM4细胞24 h后,细胞内Bax相对表达量(73.82±4.53%与空白对照组(10.73±0.26%相比极显著增高(P<0.01);若细胞先经GSPE提前作用2 h,再由cDDP诱导作用24 h,则此时细胞内Bax相对表达量(36.44±3.13%cDDP模型组相比极显著降低(P<0.01);0.005 mg/mLGSPE单独作用于TM4细胞,其细胞内Bax相对表达量((9.75±1.42%)与正常TM4细胞内Bax相对表达量不存在显著性差异。


如图69所示,终质量浓度为0.014 mg/mLcDDP作用于TM4细胞24 h后,细胞内Pro-caspase 3相对表达量(31.13±0.94%与空白对照组(70.21±2.82%相比极显著降低(P<0.01);若细胞先经GSPE提前作用2 h,再由cDDP诱导作用24 h,则此时细胞内Pro-caspase 3相对表达量(40.36±2.43%cDDP模型组相比极显著升高(P<0.01);0.005 mg/mLGSPE单独作用于TM4细胞,其细胞内Pro-caspase 3相对表达量((74.93±3.25%)与正常TM4细胞内Bax相对表达量不存在显著性差异。


如图610所示,终质量浓度为0.014 mg/mLcDDP作用于TM4细胞24 h后,细胞内Caspase-3相对表达量(27.35±1.54%与空白对照组(13.76±0.71%相比极显著增高(P<0.01);若细胞先经GSPE提前作用2 h,再由cDDP诱导作用24 h,则此时细胞内Caspase-3相对表达量(15.64±0.86%cDDP模型组相比极显著降低(P<0.01);0.005 mg/mLGSPE单独作用于TM4细胞,其细胞内Caspase-3相对表达量((14.37±0.33%)与正常TM4细胞内Caspase-3相对表达量不存在显著性差异。 

GSPEcDDP诱导的TM4细胞各蛋白表达变化情况结果表明,GSPE0.005 mg/mL)可有效拮抗cDDP0.014 mg/mL)诱导TM4细胞细胞凋亡,显著增强Bcl-2Pro-caspase 3表达,极显著抑制BaxCaspase-3表达(P<0.01);0.005 mg/mL GSPE单独作用于TM4细胞,其细胞内各基因表达量与正常TM4细胞内基因表达量均不存在显著性差异。 



讨    论


本研究结果显示,当GSPE终质量浓度浓度为0.005 mg/mL时,对cDDP诱导的TM4细胞毒性有明显的抑制作用。本研究结果也显示,cDDP可显著促进TM4细胞的凋亡。 

本研究从细胞凋亡角度进一步探究GSPEcDDP所致TM4细胞毒性作用的影响,研究结果显示GSPE可明显抑制cDDP诱发的小鼠睾丸支持细胞凋亡,同时cDDP单独用药后,TM4细胞内Bcl-2相对表达量以及处于酶原状态Pro-caspase 3的相对表达量显著降低,而Bax和处于激活状态的Caspase-3相对表达量明显增加,提示Bcl-2BaxCaspase-3等基因参与cDDP诱导TM4细胞凋亡,细胞凋亡在cDDP诱导TM4细胞毒性过程中起重要作用。GSPE拮抗因cDDP诱导的细胞凋亡其确切的分子机制目前仍不明确,其中一个可能的解释即为GSPE对凋亡相关基因表达的影响。本研究结果显示GSPE可明显降低Bax以及Caspase-3的蛋白表达量,增加Bcl-2Pro-caspase 3的蛋白表达量,阻抑cDDP诱导TM4细胞的凋亡。 

综上所述,GSPE提前作用TM4细胞后,对cDDP诱导的细胞毒性损伤有保护作用,其机制可能通过上调Bcl-2蛋白表达、下调BaxCaspase-3的蛋白表达,从而发挥抗细胞凋亡作用而实现的。 




本文《葡萄籽原花青素对顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞TM4细胞凋亡的影响》来源于《食品科学》2020年41卷9期98-104页,作者:杜月梅,韩何丹,郭卓雨,高丽萍。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190426-343。点击下阅读原文即可查看文章相关信息。



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修改/编辑:袁月;责任编辑:张睿梅
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